2023年01月03日，Plant Physiology在線(xiàn)發(fā)表了生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院宋躍朋教授課題組“Enhanced genome-wide association reveals the role of YABBY11-NGATHA-LIKE1 in leaf serration development of Populus”的研究論文。該研究以葉形差異顯著的毛白楊與小葉楊種質(zhì)資源群體為材料，通過(guò)持續(xù)同調(diào)（Persistent homology）拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析方法完成葉片形態(tài)特征的高通量量化，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析策略，對(duì)調(diào)控毛白楊與小葉楊葉形變異的關(guān)鍵基因定位。研究發(fā)現(xiàn)植物特異的葉片發(fā)育調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子YABBY11與楊樹(shù)葉形自然變異顯著關(guān)聯(lián)。基因功能解析表明在毛白楊基因組中YABBY11攜帶提前終止位點(diǎn)（PtoYAB11PSC）,致使其鋅指結(jié)構(gòu)域缺失，進(jìn)而喪失對(duì)下游靶基因PtoNGAL-1與PtoRBCL的轉(zhuǎn)錄激活作用，導(dǎo)致葉片邊緣的鋸齒加劇、面積增大、光合利用效率提升。
葉片的形態(tài)特征是影響植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、產(chǎn)量以及果實(shí)品質(zhì)等重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵因素。通常更寬更薄的葉片具有更高的光合利用效率與氣體交換能力。因此，探索植物理想葉形形成的分子機(jī)制并實(shí)現(xiàn)遺傳改良是植物育種學(xué)研究的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。相對(duì)于植物的其他形狀，葉形的變異較為顯著，并且受年齡效應(yīng)與環(huán)境效應(yīng)的影響顯著。葉片形狀的形成取決于葉片相對(duì)于中軸的正面和背面的發(fā)育過(guò)程。已有的研究表明，該過(guò)程涉及一個(gè)植物激素、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層級(jí)的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。盡管，在高等植物中鑒定出了一些調(diào)控葉片形態(tài)的候選基因以及miRNA，但是，調(diào)控葉片自然變異的關(guān)鍵基因尚未見(jiàn)正式報(bào)道。
圖1 楊樹(shù)自然群體葉形變異顯著
楊樹(shù)葉片形態(tài)變異豐富，在種間與種內(nèi)都存在顯著的自然變異。為解析楊樹(shù)葉片形態(tài)自然變異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，研究者利用兩種葉形顯著差異的楊樹(shù)——毛白楊與小葉楊種質(zhì)資源群體為研究材料。利用持續(xù)同調(diào)拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析方法將楊樹(shù)葉片形態(tài)量化為112個(gè)表型值。其中，54%的葉片表型性狀廣義遺傳力大于0.4，屬于中高遺傳力性狀。GWAS結(jié)果顯示在毛白楊群體中有138個(gè)SNP位點(diǎn)與9個(gè)葉片表型顯著關(guān)聯(lián)，在小葉楊群體中，有171SNPs位點(diǎn)與8個(gè)葉片表型顯著關(guān)聯(lián)。在兩個(gè)關(guān)聯(lián)群體中，基因型-表型關(guān)聯(lián)顯著性最高的SNPs均位于YABBY11基因上。候選基因序列分析表明在毛白楊群體中，YABBY11攜帶提前終止位點(diǎn)（PtoYABBY11PSC），提前終止的氨基酸序列與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域完全丟失，僅保留了核定位信號(hào)。研究者選擇YABBY11為候選基因構(gòu)建楊屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示提前終止位點(diǎn)僅存在白楊派中，暗示了YABBY11PSC可能是一個(gè)白楊派特異的基因變體。
圖 2 基于持續(xù)同調(diào)拓?fù)鋽?shù)據(jù)高通量量化的全基因組關(guān)聯(lián)分析
圖3 楊屬YABBY11基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
為闡明PtoYABBY11PSC攜帶的提前翻譯終止位點(diǎn)是否改變了YABBY11下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究者利用表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)定位策略（eQTNs）分別對(duì)毛白楊和小葉楊群體YABBY11核酸變異與表達(dá)量進(jìn)行分析。在毛白楊群體中，97個(gè)SNPs與55個(gè)基因表達(dá)量顯著關(guān)聯(lián)，其中包括與7個(gè)基因形成的42個(gè)cis-eQTNs以及48個(gè)基因形成的65個(gè)trans-eQTNs。在小葉楊群體中，共發(fā)現(xiàn)61個(gè)SNPs與52個(gè)基因形成表達(dá)量顯著關(guān)聯(lián)，其中包括與10個(gè)基因形成的27個(gè)cis-eQTNs 以及42個(gè)基因形成的44個(gè)trans-eQTNs。通過(guò)對(duì)下游靶基因功能注釋?zhuān)@示PtoYABBY11PSC與PsiYABBY11下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因顯著不同，暗示PtoYABBY11PSC攜帶的提前翻譯終止位點(diǎn)已經(jīng)顯著改變了毛白楊YABBY11下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
由于PtoYABBY11PSC鋅指結(jié)構(gòu)域缺失，并且下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯著改變。研究者利用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)以及DAP-seq技術(shù)，對(duì)具有完整轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的PsiYABBY11下游靶基因進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示在164個(gè)基因上共篩選到220個(gè)PsiYABBY11互作位點(diǎn)，其中37.5%的互作位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以前2000bp范圍內(nèi)。對(duì)PsiYABBY11下游靶基因進(jìn)行KEGG通路注釋?zhuān)Y(jié)果表明其下游靶基因主要富集在photosynthesis, oxidative phosphorylation, starch and sucrose metabolism, 以及 ribosome等通路中。聯(lián)合eQTNs與DAP-seq分析結(jié)果，共篩選出NGAL1, RBCL, PHOTOSYSTEM II REACTION CENTER PROTEIN B (PSBB), ATP SYNTHASE SUBUNIT ALPHA (ATPA)以及ATP SYNTHASE EPSILON CHAIN (ATPE) 基因?yàn)镻siYABBY11的下游靶基因。利用酵母單雜交與凝膠遲滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，證明PsiYABBY11可以和NGAL1 與RBCL基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合。雙熒光素酶實(shí)現(xiàn)表明PsiYABBY11可以激活NGAL1 與RBCL基因表達(dá)。進(jìn)一步利用酵母單雜實(shí)驗(yàn)證明了NGAL1與其下游生長(zhǎng)素響應(yīng)靶基因CUC2在楊樹(shù)基因組也存在相互作用。該結(jié)果表明，YABBY11-NGAL1-CUC2 可能通過(guò)調(diào)控楊樹(shù)葉邊緣發(fā)育進(jìn)而導(dǎo)致葉片形態(tài)的自然變異。
為進(jìn)一步解析PtoYABBY11PSC與PsiYABBY11的分子功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，對(duì)PtoYABBY11PSC與PsiYABBY11進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，結(jié)果顯示PtoYABBY11PSC-OE植株葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積顯著增加，光合作用效率顯著提升，葉片邊緣鋸齒顯著加劇。PtoYABBY11PSC-OE植株葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積顯著減小，光合作用效率降低，葉片邊緣光滑，但是葉脈厚度與氣孔密度顯著增加。為進(jìn)一步驗(yàn)證PtoYAB11PSC的功能，研究者利用毛白楊群體基因組數(shù)據(jù)，在PtoYAB11PSC僅有的174bp范圍內(nèi)排除SNPs的干擾，設(shè)計(jì)gRNAs，利用Cas9編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了PtoYAB11PSC敲除（PtoYAB11PSC-KO）。PtoYAB11PSC-KO植株顯示葉片邊緣光滑，但是光合作用效率與葉片面積沒(méi)有顯著改變。
圖 4 PsiYABBY11與PtoYABBY11PSC分子功能解析
綜合以上研究結(jié)果表明，在楊樹(shù)基因組中，YABBY11通過(guò)反式調(diào)控作用激活NGAL1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制CUC2基因表達(dá)，調(diào)控光滑葉緣的形態(tài)發(fā)育。同時(shí)，YABBY11 激活RBCL基因表達(dá)，導(dǎo)致Rubisco大小鏈裝配失調(diào)，進(jìn)而光合作用效率顯著下降。而在白楊派樹(shù)種中，YABBY11PSC由于攜帶翻譯提前終止位點(diǎn)，喪失了對(duì)NGAL1-CUC2模塊以及RBCL基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，進(jìn)而導(dǎo)致葉片面積增大、葉片鋸齒加劇、光合作用效率提升。此外，YABBY11基因在毛白楊與小葉楊基因組中均對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)信號(hào)響應(yīng)敏感，暗示了YABBY11-NGAL1-CUC2模塊可能是基因組與外界環(huán)境信號(hào)互作調(diào)控葉形變異的關(guān)鍵分子調(diào)控模塊。該模塊為系統(tǒng)了解葉形響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)產(chǎn)生自然變異提供了一個(gè)全新的視角，為探索理想葉形遺傳改良奠定了理論基礎(chǔ)。
圖 5 楊屬YABBY11調(diào)控葉形自然變異的分子機(jī)制
北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院碩士研究生劉鵬與博士研究生卜琛皞為論文共同第一作者，宋躍朋教授為通訊作者，陳盼飛博士以及英屬哥倫比亞大學(xué)的Yousry A. El-Kassaby教授參與了該研究，林木分子育種團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人張德強(qiáng)教授給予該工作總體指導(dǎo)。該研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD2200101）、國(guó)家林業(yè)和草原局青年拔尖人才項(xiàng)目（No.2020132606）以及國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31770707）以及111引智計(jì)劃（B20050）等項(xiàng)目資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1093/plphys/kiac585
